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动物细胞培养技术简介
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动物细胞培养技术起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。1885年,有位科学家把鸡胚髓板在温热的盐水中维持其存活10天,是有记录的第一个体外移植成功的例子。1887年,另一位科学家把白细胞收集在盛有盐水的小碟子里,并观察到这些白细胞在运动,并存活了一段时间。由于当时的培养基并不理想,因此实验难以重复,并也难以证明这些先驱者所培养的是否是真正存活的健康的组织和细胞。 

  其后,卡瑞乐不但发现鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应,还把无菌技术方面的知识带到了组织培养技术中来。他在完全没有抗菌素的条件下竟使鸡胚心脏的细胞维持生存了34年,先后传代3400次,令人信服地证明动物细胞有可能在体外无限地生长。 

  虽然动物细胞培养的基本原理和微生物细胞相同,但动物细胞对于营养要求更加苛刻,对于培养的环境适应性更差,培养时间要求更长。这给动物细胞培养带来了一定的难度。 

  动物细胞的培养对营养的要求较高,往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子等,其中很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供,在很多情况下还需加入10%的胎牛或新生牛血清。血清是一种很好的营养物质,绝大多数细胞在含有胎牛或新生牛血清的培养基中生长得最好,但它的来源比较困难,而且它的成分不确定,使得生长过程不易检测控制。任何血清使用前必须经过鉴定,只有无菌、无内毒素、无溶血或低溶血、 蛋白质以及营养素达一定标准以上的血清才能使用。有的细胞,能在无血清培养基中生长。用渐适法可使本来需要血清的细胞适应于在无血清培养基中生长。

  动物细胞培养的另一个突出特点,是对环境条件要求严格。所以对这些条件严加控制,可以大幅度促进生长。例如,二倍体成纤维细胞在控制pH的情况下,比在可变pH的情况下生长得好得多。另一方面,动物细胞生长缓慢,它们对环境的影响又比微生物为大,因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。这不仅增加了培养的代价,也给过程的检测控制带来了困难。动物细胞培养还需要防治污染问题,细菌、真菌、病毒或细胞均可致动物细胞培养物的污染。而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以至环境均可引起污染。显著污染的标志是培养基pH值迅速改变,外形模糊,甚至出现漂浮的集落。 污染通常表明操作者技术上的失误或设备及用具出了毛病,特别是小牛血清的支原体污染及组织材料的污染问题更难以对付。 

  动物细胞培养和植物细胞培养一样需要经历一个初代培养的过程。所谓初代培养是指直接从有机体得到的组织或将其分散成细胞后开始的培养。转移一部分初代培养物到新鲜培养基中的培养,叫做次代培养或再培养。 

  由初代培养产生的,能进行无限次代培养的细胞群称做细胞系。人们发现,各种动物细胞系的细胞虽然在体外保持了许多起源细胞的功能和形态分化的特征。但由于环境的选择和对环境的适应,这些细胞与体内的起源细胞依然有许多不同,这种相异之处不但在体外培养的早期阶段即可出现,而且在长期稳定传代的过程中还会由于变异而不断变化,甚至产生起源细胞所没有的特征。因此,体外动物细胞在形态结构上均程度不同地与原来的细胞有所差异,活动度较大。

  动物细胞培养中,还发现了一个有趣的现象,即大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长,当细胞布满表面后即停止生长,这时若取走一片细胞,存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化,这种细胞的培养称为单层附壁培养。附壁培养的细胞可用胰蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法处理,使之从生长表面上脱落下来。 

  当然,也有一些细胞,如淋巴细胞,能够在悬浮状态生长。还有一些细胞,既可附壁生长, 也可悬浮生长。悬浮培养类似微生物的深层培养。这种方法有多方面的优越性,易于大规模生产,便于过程的控制。可惜能在悬浮状态下生长的细胞种类有限。淋巴细胞等不附壁生长的细胞已成功地进行了悬浮培养。大规模培养可采用培养微生物细胞用的发酵罐,但须将其稍加改进,如将搅拌转速减慢、搅拌叶改用螺旋桨式、通气装置通过硅橡胶管扩散的方式等。 

  事实上绝大部分哺乳类细胞尤其正常细胞均具贴壁依赖性生长的特征,即使肿瘤细胞亦非很易适应悬浮生长的环境。于是,在大量培养哺乳类细胞的技术中引入了两种十分理想的载体:空心纤维和微珠。空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合物所织成的可透性滤膜, 外径为l/3~1/4毫米。微珠是直径很小、相对密度稍大于1的固体颗粒,通过搅拌可使无悬浮状态细胞在颗粒表面上单层生长。在微珠上培养的细胞,每个细胞产生抗原、干扰素等的能力,与常规单层附壁培养的细胞相当。微珠培养法克服了常规培养等方法的缺点,使附壁细胞的培养具有悬浮培养的优点,在培养规模的扩大和系统的检测控制等方面,展现出诱人的前景。 

  细胞培养也是病毒的分离和培养中不可缺少的工具。病毒学研究中的许多重要的结果是用培养细胞取得的。因为大多数病毒性疾病可以用抗血清来治疗,所以为了病毒的鉴定和疫苗的生产,有必要大量培养病毒。病毒培养还可以用来进行细胞转化。病毒侵入细胞后,其基因组可能整合到细胞染色体上,从而改变细胞的特性。

  近年来发展起来的淋巴细胞杂交瘤技术,使动物细胞培养进入了一个新的领域。杂交瘤也称杂合瘤或杂种瘤,是由骨髓瘤细胞和B淋巴细胞或血浆细胞原生质体融合而得的杂合细胞。骨髓瘤细胞能在体外培养中大量繁殖,免疫的淋巴细胞能分泌特异抗体。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大量繁殖并产生单克隆抗体。 

  随着基因重组技术和单克隆抗体技术的进展,动物细胞培养展现出越来越可观的工业化前景。动物细胞培养技术不仅在实验室,而且在大规模工业生产中已经逐渐得到应用。近来,已经启用了300升和1000升的培养罐分别用于生产单克隆抗体和灰色脊髓炎疫苗。
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